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Journal of the Korean Chemical Society (JKCS)

ISSN 1017-2548(Print)
ISSN 2234-8530(Online)
Volume 49, Number 5
JKCSEZ 49(5)
October 20, 2005 

 
Title
Characterization of Phospholipase D Activity in Vero 76 Cells Permeabilized by Digitonin

디지토닌으로 투과성을 높인 Vero 76 세포의 포스포리파제 D 특성
Author
Eun-Hie Koh*

고은희*
Keywords
포스포리파제 D, 디지토닌, Vero76 세포 , Phospholipase D, Digitonin, Vero76 cells
Abstract
포스포리파제 D의 활성은 세포막 교란을 포함한 다양한 세포신호전달 체계를 통해 조절되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에는 Vero 76 세포(원숭이 신장 상피세포)의 포스포리파제 D에 대한 디지토닌 영향을 검토하였다. Vero 76 세포의 포스포리파제 D는 디지토닌 농도가 30 μg/mL 조건에서 세포를 37oC에서 30분간 배양했을 때 그 활성이 약 9배 정도 증가하였다. 이 조건하에서 디지토닌에 의한 세포막의 투과성 증가는 형광 현미경으로 확인할 수 있었다. 디지토닌에 의해 유도된 포스포리파제 D의 활성은 EGTA에 의해 70%이상 저해됨을 발견하였으며, 이와 함께 각종 단백질 키나제 저해물질들을 선처리 했을 때 PD98059 와 Ro32-0432의 경우 디지토닌에 의해 야기된 포스포리파제 D의 활성이 크게 저해됨을 관찰할 수 있었다. 이들 저해물질의 결과는 단백질 키나제 C의 관여를 암시하며, 이는 PMA로 24시간 동안 처리한 세포에서 디지토닌의 영향이 상당 부분 막힌다는 것으로 재확인 할 수 있었다. 그 외 디지토닌 존재 하에서 Vero 76 세포의 생존능력을 조사했으며, 포스포리파제 D1와 D2를 Vero 76 세포에 발현시켜 그 포스포리파제 D에 대한 디지토닌의 영향을 검토하였다.

Phospholipase D (PLD) activity is known to be modulated through cellular signaling pathways including membrane perturbation. In this study, we examined effect of digitonin on the PLD activity in monkey kidney epithelial Vero76 cells. At 30 μg/mL dosage of digitonin, the PLD activity was induced approximately 9 folds within 30 min at 37oC. Under the same condition the increased membrane permeability could be verified by fluorescence microscope. The digitonin-induced PLD activity was inhibited as much as 70% by EGTA and pretreatment with various protein kinase inhibitors such as PD98059 and Ro32-0432 significantly decreased the digitonin-induced PLD activity. The results of inhibitor studies suggest an involvement of protein kinase C. This finding was further verified by blocking digitonin effect by the pretreatment with PMA for 24 hours. Additionally we examined the viability of Vero76 cells under the digitonin influence and tested the digitonin effect on the Vero76 cells transiently transfected with PLD1 and PLD2 cDNAs.

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