Journal Information
Journal ID (publisher-id): chemical
Title: 대한화학회지
Translated Title (en): Journal of the Korean Chemical Society
ISSN (print): 1017-2548
ISSN (electronic): 2234-8530
Publisher: 대한화학회Korean Chemical Society
서 론▼
셀레늄(selenium, Se)은 비타민E의 2,000배 이상 강력한 항산화 효과가 있는 것으로 알려지면서 인체 건강과 관련하여 그 중요성에 대한 인식이 점차 높아지고 있다.1 셀레늄은 필수 미량 원소로 지정되었으며2,3 체내에서 다양한 형태로 존재한다. 셀레노메티오닌(Selenomethionine, SeMet)이나 셀레노시스테인(Selenocysteine, SeCys)과 같은 아미노산, 신진대사물의 결과인 당류로도 존재하고, 또한 글루타티온 과산화효소(Glutathione Peroxidase, GPx)등의 단백질로도 존재하며 인체에서 항산화기능등4의 중요한 역할을 담당한다. 셀레늄은 결핍시 면역기능 이상, 갑상선 기능 장애, 퇴행성 신경장애 등 다양한 질병의 원인이 될 수 있으나 과다 복용시에는 셀레노시스(Selenosis)를 유발하여 탈모, 손톱 손실, 피부 안면 신경계의 병변, 피로 및 과민증 등 부작용을 초래할 수 있어 건강과 관련한 중요한 모니터링 대상이다.5,6
체내의 셀레늄 농도를 모니터링하고 분석하는 방법으로는 소변, 호흡, 전혈, 혈장, 적혈구 등의 생체 시료를 직접적으로 분석하거나 적혈구, 혈소판, 근육 속 GPx의 활성을 측정하는 간접적인 분석방법등이 있다.7 혈액과 소변은 특별한 전처리가 필요하지 않고, 분석하는 과정이 간단하기 때문에 체내의 셀레늄 농도를 측정할 때 가장 쉽게 이용할 수 있는 생체 시료이다. 특히 여러 암과 혈액속 셀레노 단백질의 종류와 농도 사이의 상관관계 연구가 매우 활발하게 이루어지고 있다.2,8,9 이 들 시료는 인체나 생체에서의 셀레늄 섭취에 따라 시간적으로 즉각적인 결과를 보인다. 소변 시료 또한 빠른 정보교환으로 이에 대한 연구도 활발하다.10,11 하지만 혈액이나 소변 등을 통해 셀레늄 농도를 분석하는 방법은 단기간의 셀레늄 노출만 반영한다는 단점이 있다.
손톱, 발톱, 모발 등은 셀레늄 대사 후 배출되는 셀레노 화합물들이 장기간 축적되기 때문에 장기간의 셀레늄 노출을 반영하는 시료이며12 손발톱에는 다른 여러 중금속들도 생체내의 정보를 반영하기 때문에 중금속을 포함하여 여러 금속 비금속에 대한 연구들이 진행되어 왔다.13−16 또한, 손톱에서의 여러 화학종들에 대한 정보를 이용하여 환자들의 건강상태를 검진하거나 진단하는 목적으로 biomarker로서의 가능성을 연구하기도 하였다.17
장기간의 셀레늄 노출, 식단을 통한 셀레늄 섭취 또는 셀레늄 영양보조제를 장기간 섭취한 경우에는 소변 시료에서는 확인할 수 없는 장기간 노출에 대한 정보를 얻을 수 있다는 점에서 손톱과 발톱 및 모발에서의 셀레늄에 대한 연구는 매우 중요하다고 보인다.18 Allen19은 4537명을 대상으로 한 전립선암에 관한 광범위한 연구에서 혈장에서의 셀레늄 농도보다는 손톱에서의 셀레늄 농도가 전림선암과 더욱 밀접한 관계를 보여주는데 이 는 혈중 농도는 단기간의 셀레늄농도를 반영하지만 손톱은 체내에서의 장기간의 농도를 반영하므로 오히려 암과의 상관관계가 더 클 수 있다고 결론지었다.
한편 모발은 손톱에 비하여서는 체내의 여러 금속의 농도와 비교할 때 그 연관성이 적다고 알려져 있는데 그 이유는 모발은 체내뿐 아니라 외부적 환경적 요인에 의한 농도의 변화가 심하기 때문이다. 하지만 그렇다 해도 손톱만큼은 아니지만 어느 정도 체내의 금속에 대한 여러 정보를 반영하고 있다.13
체내의 셀레늄은 매우 미량으로 존재하기 때문에 정확한 분석이 필요하다. 유도결합 플라즈마 질량분석기(Inductively Coupled Plasma/Mass Spectrometry, ICP/MS)는 ppb~ppt 단위의 낮은 농도까지 높은 정밀도로 측정가능하기 때문에 Se 분석에서 많이 사용된다.20 최근 휴대용 X선형광법으로 분석법을 개발한 연구21가 있으나 간편하고 빠르기는 하지만 그 검출한계가 높아(~800 ppb) 본 연구와 같은 미량 농도의 경우에는 적합하지 않은 것으로 보인다.
ICP/MS를 이용한 동위원소 희석법(Isotope Dilution Analysis, IDA)은 ppb 단위의 낮은 농도까지 정확하게 정량할 수 있는 매우 효과적인 정량방법이다.22,23 IDA는 기계의 감도, 바탕효과의 영향을 받지 않으며 시료와 스파이크 용액이 잘 혼합되면 혼합물의 손실이 있어도 시료의 농도를 정량하는데 영향을 미치지 않기 때문에 검정곡선법, 표준물 첨가법 등의 정량방법 보다 매우 높은 정확도와 정밀도를 지닌 분석법이다.24
여러 화학종을 한꺼번에 분리하고 분석하는 화학종 연구에서는 후 컬럼 동위원소 희석법(Post Column Isotope Dilution, PCID)이 사용될 수 있는데 이 는 시료화합물에 대한 동위원소 표지 표준물이 없어도 동위원소 희석법이 가능한 유용한 정량분석법이다. PCID 방법은 HPLC 컬럼을 지나며 분리된 시료에 동위원소 셀레늄 스파이크를 지속적으로 넣어주며 달라지는 동위원소비를 측정하여 각 화학종들의 농도를 정량하는 방법25으로 본 연구에 적합한 방법이다.
실 험▼
연구에 사용된 질산은 동우화인켐(Pyungtaek, Korea)의 반도체급시약을 사용하였다. Sodium selenite (Se IV, 99%), Sodium selenate decahydrate (Se VI, 99.999%) DL-SeMet, L-SeCys, MeSeCys는 모두 Sigma-Aldrich (Yongin, South Korea)에서 구입하였다. HPLC 이동상으로는 ammonium acetate (≥99.99%, trace metals basis)를 사용하였다. 충돌기체로는 H2 (99.8 atom, %)를 삼성산소(Cheongju, South Korea)에서 구입하여 사용하였다.
컬럼은 음이온 교환컬럼(Hamilton PRP-X 100, 5 µm 4.6 × 250 mm))을 사용하였고 연동펌프는 Gilson Miniplus 3 (Gilson, Middleton, USA)를 사용하였다.
실험에 사용한 셀레늄 스파이크로는 76Se 동위원소(Trace Sciences International Corp, DE, USA)를 사용하였다. 아래 표에 셀레늄의 %자연동위원소비와 76Se 동위원소의 비율을 나타내었다.
Table1.
Isotopic abundances (atom, %) of natural selenium and 76Se enriched spike solution
| Se isotope | Abundance, % | |
|---|---|---|
|
|
||
| Natural selenium | 76Se enriched spike solution | |
| 74 | 0.89 | 1.2 |
| 76 | 9.37 | 98.5 |
| 77 | 7.63 | 0.2 |
| 78 | 23.77 | 0.03 |
| 80 | 49.61 | 0.01 |
| 82 | 8.73 | 0.02 |
셀레늄 영양보조제 섭취에 따른 손톱 속 셀레늄 농도 변화 실험에 참여한 실험참여자들은 매일 22 µg 씩 매일 3개월 섭취하고 3개월 휴식하기를 2회 반복하였으며 실험은 1년간 진행되었다. 이 때 평소의 식단 위에 효모(주로 SeMet)에서 기인한 셀레늄 보조제(Natural Life Nutrition Inc., British Columbia, Canada)를 섭취하였다. 추가 실험에서는 300 µg day−1를 2개월 복용하였다. 손톱제공자들인 실험군에 대한 정보는 다음 Table 2에 나타난 바와 같다.
Table2.
Information on volunteers who provided fingernails for selenium analysis
| Male/Female | Age | |
|---|---|---|
| Volunteer 1 | Male | 27 |
| Volunteer 2 | Female | 24 |
| Volunteer 3 | Male | 23 |
| Volunteer 4 | Female | 28 |
| Volunteer 5 | Female | 33 |
제공받은 손톱 시료는 37 ℃에서 아세톤-증류수-아세톤의 순서로 10분간 세척하였고 110 ℃에서 2시간 건조하였다. 손톱 속 셀레늄을 효과적으로 추출하기 위해 세라믹 가위를 이용하여 건조한 손톱 시료를 가로 세로 약 2 mm 크기 이하로 조각내었다.
총량분석을 위한 마이크로파 분해법
시료내의 총량을 분석하기 위하여 마이크로파 분해법을 이용하여 손톱과 모발 시료를 처리하였다. 세척하고 건조시킨 손톱 시료 약 0.05 g을 테플론 비커에 넣고 셀레늄 동위원소 스파이크 용액, 31% H2O2 및 70% HNO3를 넣고 200 ℃에서 40분 동안 분해하였다. 분해가 완료된 시료 용액은 0.45 µm 필터로 걸러서 사용하였다.
모발시료에 대해선 실험참여자의 모발 시료를 뿌리 부분에서부터 6 cm 가량 채취하였다. 채취한 시료를 뿌리에서부터 2 cm씩 A, B, C 시료로 나누어 산 분해하였다. 산 분해 조건은 손톱과 동일하였다. 시료의 총 셀레늄 농도는 동위원소희석법으로 정량하였다.
손톱과 모발에서의 셀레늄 화학종 추출
실험참여자의 손톱 시료를 아세톤-증류수-아세톤 순서로 세척한 후 건조하여 세라믹 가위로 가로 세로 2 mm 이하로 잘게 자른 뒤 0.1 M NaOH로 추출하였다. 이 때 온도는 37 ℃와 90 ℃로 나누어 추출효율을 비교하였다.
먼저, 37 ℃에서는 손톱 시료 약 0.05 g을 25 mL 비이커에 넣고 0.1 M NaOH 용액 5 mL를 넣어준 후 24시간 동안 저어주며 추출하였다. 24시간 후 1 M HNO3 0.5 mL를 넣어 주어 중화하고 원심분리하였다. 상등액과 residue를 분리하여 상등액은 0.45 µm 필터로 거르고, residue는 마이크로파 산 분해 전처리 후 사용하였다.
90 ℃에서는 0.05 g을 50 mL conical tube에 넣고 0.1 M NaOH 용액 5 mL를 넣어준 후 수조에서 8시간 동안 추출하였다. 8시간 후 상온으로 식힌 후 1 M HNO3 0.5 mL를 넣어 중화시키고 0.45 µm 필터로 거른 뒤 사용하였다. 모발시료의 경우에는 실험참여자의 모발 시료 0.1 g을 50 mL conical tube에 넣고 0.1 M NaOH 용액 5 mL를 넣어준 후 90 ℃ 수조에서 3 시간 동안 추출하였다. 3 시간 후 상온으로 식힌 후 1 M HNO3 0.5 mL를 넣어 중화시키고 0.45 µm 필터로 걸러서 사용하였다. Filtering 한 시료는 HPLC-ICP-MS로 분석하여 PCID법으로 정량하였다.
결과 및 고찰▼
상온인 37 ℃에서 추출되는 셀레노 화합물의 양을 알아내기 위해 하나의 시료를 반씩 나누어 마이크로파 산 분해와 상온추출을 병행하여 진행하였다. 두 농도값을 비교하고 추출 효율결과를 다음의 Table 3에 나타내었다.
Table3.
Selenium in finger nails extracted at 37 ℃, 0.1 M NaOH for 24 hours (n=3)
| Se, ng g−1 | Efficiency, % | |
|---|---|---|
| Total digestion | 786.1 ± 64.7 | 49.8% |
| NaOH extraction | 391.8 ± 37.8 |
37 ℃에서 0.1 M NaOH의 추출 효율은 49.8% 정도로서 완전히 추출되지 않음을 확인할 수 있었다. 추출된 셀레늄이 어떤 형태로 존재하는지 확인하기 위해 용액을 HNO3로 중화한 후 HPLC-ICP-MS로 분석하였고 크로마토그램을 Fig. 1에 나타내었다.
Figure1.
Chromatograms of finger nail extraction solution (solid line) and spiked with SeCys (25 µg g−1 Se; dotted lines).
손톱 추출액의 크로마토그램을 보면 4 min에 나타나기 시작한 피크는 SeCys인데 SeCys스파이크를 첨가하여 확인할 수 있었다. 인체 내 조직 속 셀레노아미노산의 주된 화학종은 SeCys인 것이 알려져 있지만6 셀레늄 대사 후 손톱으로 배출되는 셀레늄 화합물도 SeCys이라는 것은 꽤나 흥미로운 사실이다. 하지만 손톱 효율이 절반 정도 밖에 되지 않기 때문에 손톱 속에 SeCys 외에 다른 화학종이 존재할 가능성도 아직 남아있다고 볼 수 있다.
손톱 속 셀레노 화합물 90 ℃ 추출 분석
7개의 손톱 시료를 90 ℃ 온도 조건에서 추출한 셀레노 화합물을 Fig. 2에 나타내고 그 농도와 총량 분석한 농도를 비교하였다.
90 ℃ 추출액의 크로마토그램을 보면 37 ℃와 마찬가지로 SeCys 피크 이외에 다른 피크는 나오지 않고 있다. 90 ℃ 추출액의 경우에도 마찬가지로 손톱 속에는 SeCys 한가지 화학종만 존재한다고 볼 수 있다.
추출한 셀레늄 화합물의 화학종 분석을 위하여 HPLC-ICP/MS를 사용하고 후 컬럼 동위원소 희석법으로 정량한 다음, 그 결과 값을 총 셀레늄 농도와 비교하여 Fig. 3에 나타냈다. 추출된 SeCys의 값은 IDA방법으로 분석한 총 셀레늄의 농도를 비교해 볼 때에 nail 7을 제외하고는 같은 값을 보여준다. 즉, 손톱에서의 셀레늄 화합물은 주로 SeCys이며 90 ℃에서 8시간 추출했을 이 들은 거의 다 추출된다고 결론지을 수 있다.
셀레늄 영양보조제 섭취에 따른 모발 속 셀레늄 분석
셀레늄 영양보조제 섭취에 따른 모발 속 셀레늄 농도 변화를 확인하기 위해 2개월 동안 22 µg day−1 섭취한 여성 실험 참여자의 모발을 모근에서부터 6 cm 가량 채취하였고, 채취한 시료를 A (모근부터 2cm), B (2 cm ~ 4 cm), C (4 cm ~ 6 cm)로 3등분하여 IDA로 셀레늄 총량 분석하였다. 또한 모발 속 셀레노 화합물을 확인하기 위하여 모발을 90 ℃에서 0.1 M NaOH 용액으로 3시간 동안 추출한 추출액을 HPLC-ICP-MS로 분석하였다. 모발 시료 A, B, C에 대한 셀레늄 총량을 Table 4에 나타냈다.
Table 4를 보면 A, B, C 시료로 갈수록 모발 속 셀레늄의 농도가 감소하는 것을 볼 수 있고, C는 A와 B에 비해 좀 더 낮은 농도임을 확인하였다. 모발이 한 달에 약 2 cm 자란다고 볼 때 2개월 동안 셀레늄 을 섭취하여 모발 속 셀레늄의 농도가 증가할 것으로 생각되는 부분은 모근 ~ 4 cm 이므로 C 시료가 농도가 가장 낮게 나온 것은 어느 정도 예상할 수 있었다. 모발 전체에 대한 평균농도는 205.3 ng g−1이다. 이 값을 셀레늄을 일년 동안 11 µg day−1 섭취한 중국인 여성 20명의 모발을 분석한 연구에서 모발 속 셀레늄의 농도가 0.26 ± 0.11 µg g−1 인 것과 비교하였을 때 어느 정도 비슷한 결과를 얻을 수 있었다.24
Table4.
Total concentration of selenium in hair
| Se, ng g−1 (n=3) | |
|---|---|
| A (root ~ 2 cm) | 215.6 ± 3.9 |
| B (2 cm ~ 4 cm) | 207.0 ± 2.6 |
| C (4 cm ~ 6 cm) | 193.3 ± 3.2 |
모발 속 셀레노 화합물을 확인하기 위해 추출한 시료를 HPLC-ICP-MS로 분석하여 얻은 크로마토그램을 Fig. 4에 나타냈다.
모발 시료 NaOH 추출 용액의 크로마토그램을 보면 손톱 추출액의 크로마토그램과 마찬가지로 4 min.부터 시작하는 SeCys 피크 한 개만 나타난다.
셀레늄 영양보조제 섭취 기간에 따른 손톱 속 셀레늄 총량 분석
셀레늄 영양보조제를 섭취한 5명의 실험참여자의 손톱을 2017년 12월부터 2018년 12월까지 1년 동안 3주마다 채취하여 셀레늄 총량을 분석하였다. 5명의 실험참여자는 평소 식단 이외에 하루에 22 µg의 셀레늄을 섭취하였으며 3개월 섭취 3개월 휴식을 반복하였다. ICP-MS를 이용한 IDA로 총량 분석하기 위해서는 시료의 질량이 0.03 g 이상 필요하기 때문에 자란 손톱을 끝에서부터 잘라내는 방식으로 채취하였다. Fig. 5에 실험참여자 5명에 대한 손톱에서의 셀레늄 농도의 변화를 나타내었다.
Fig. 5에서 빗금 친 기간은 셀레늄 영양보조제를 섭취중인 기간을 나타낸 것이며 빗금이 없는 기간은 섭취하지 않은 기간이다.
Figure5.
Monitoring of selenium for 5 volunteers during (shaded area) and after (white area) taking Se supplement for the period of 12 months.
실험참여자 5명 모두 개인마다 손톱 속 셀레늄의 농도 차이가 존재하지만 각 개인은 어느 정도 일정한 농도를 유지하는 것을 볼 수 있었다. 따라서 셀레늄 섭취시에 농도가 증가하는 경향성이 모두에게 공통적으로 나타날 것이라 예측하였다.
손톱은 가장 안쪽인 조모에서 신장되기 때문에 셀레늄 영양보조제를 섭취하고 약 2~3개월 뒤에 셀레늄 농도가 높아진 손톱을 채취할 수 있다. 그렇게 때문에 손톱 속 셀레늄의 농도가 증가하는 부분은 빗금친 부분이 아니라 빗금이 없는 기간으로 예상되었다.
Fig. 5에서 5명의 참여자들을 볼 때에 volunteer 3과 volunteer 5의 경우에 빗금 친 셀레늄 섭취 기간 이후에 손톱의 농도가 약간 증가하는 것을 보였지만 다른 참여자들에서는 셀레늄 보조제에 의한 농도 증가는 확인하기 어려웠다
22 µg day−1의 셀레늄을 섭취한 실험참여자들의 손톱 속 셀레늄의 평균 농도는 700 ng g−1 ~ 800 ng g−1정도이었다. Y. Xia24는 중국인을 대상으로 일년 동안 각 각 759 µg day−1, 110 µg day−1, 및 11 µg day−1을 섭취한 20명의 실험참여자들에 대하여 손톱에서의 셀레늄 농도를 분석하였다. 결과, 각각 10.4 ± 5.2 µg g−1 , 0.92 ± 0.24 µg g−1 및 0.25 ± 0.09 µg g−1을 얻었는데 본 연구 결과와 비교해볼 때 22 µg day−1의 셀레늄 섭취는 한국인의 경우에도 총 셀레늄 농도에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
그 이유는 보조제로 섭취한 량이 식품으로 매일 섭취하는 한국인의 평균섭취 셀레늄량27인 128.2 µg day−1와 비교하면 너무 작아서 그럴 수도 있고, 아니면 보조제의 생물학적 섭취효율이나 활성도가 식품에 비하여 떨어질 수 도 있는 등의 여러 이유가 있을 수 있겠다. 다만 확실한 것은 현재의 보조제의 량으로서는 손톱에 반영되는 셀레늄의 량이 크지 않으므로 그 영향을 관찰하기 위하여서는 섭취하는 보조제의 농도를 증가시킬 필요가 있었다.
셀레늄 영양보조제의 농도를 300 µg day-1로 증가한 뒤 2개월 섭취한 뒤에 다시 연구를 진행한 결과, 다음의 Fig. 6의 15개월 이후의 부분에 나타난 것처럼 손톱에서의 농도가 확연히 증가한 것을 볼 수 있었다.
Figure6.
Changes of Se concentration in finger nails during (dark area) and after (white area) taking selenium supplements of different amount of doses.
다만, 그 증가하는 정도는 Xia의 연구보다 낮았는데 이 는 본 연구에서는 셀레늄의 섭취기간이 짧으며 또한 섭취한 셀레늄은 다른 형태이므로 생물학적 활성도나 섭취효율이 달라질 수 있을 것으로 생각된다.
손톱을 대상으로 하여 연구한 결과, 높은 농도에서의 연구에서는 확실한 농도증가가 관찰되었으나, 현재 시판되고 있는 대부분의 셀레늄 보조제(22 µg day−1)의 낮은 농도에서는 인체내의 장기적인 농도변화에 큰 영향을 끼치지 않는 것으로 보인다. 하지만 본 연구는 건강한 젊은 연령층을 대상으로 하였기 때문에 평소에 매우 적은 농도의 셀레늄을 섭취하거나 또는 인체내의 셀레늄 농도가 낮은 고 연령군 또는 질병을 가진 사람들에서는 다른 연구결과가 나타날 수도 있을 것이다.
결 론▼
손톱과 모발에서의 셀레늄은 대부분 SeCys으로 구성이 되어 있음을 확인하였고 이에 따라 특별한 화학종의 분리없이 총량분석이 가능하였다. 또한, 손톱과 모발에서의 셀레늄은 장기간(수 개월 이상)에 걸친 체내의 농도변화를 잘 보여주며 이에 따라 유용한 생체지표로 사용될 수 있음을 보여주었다.