셀레늄 강화 스피룰리나에서의 낮은 분자량 셀레노 화합물 분석

연구에 사용된 sodium selenite (Se IV, 99%), sodium selenate decahydrate (Se VI, 99.999%) DL-SeMet, L-SeCys, MeSeCys는 모두 Sigma-Aldrich (Yongin, South Korea)에서 구입하였다. 스피룰리나를 분해하기 위한 효소인 streptomyces griseous type XIV, phosphate buffer solution, 및 sodium hydroxide는 모두 Sigma-Aldrich에서 구입하였고 HPLC 이동상으로는 ammonium acetate (≥99.99%, trace metals basis)를 사용하였다. 충돌기체인 H₂ (99.8 atom, %)는 삼성산소 (Cheongju, South Korea)에서 구입하였다.

셀레늄이 강화된 스피룰리나(Arthrospira platensis)는 (주)네오엔비즈(Bucheon, South Korea)에서 셀레늄 표준용액(Na₂SeO₄)으로 배양한 후, 건조시켜 분쇄시킨 분말시료를 제공받았다. 자세한 배양 조건은 Table 1에 나타내었다.

HPLC column으로는 anion exchange column을 사용하여 셀레노 화학종 표준시료 Se(IV), Se(VI), SeMet, SeCys, MeSeCys을 분리할 수 있는 최적 조건을 찾았다. 실험을 시작하기 전 이동상 0.1 M ammonium acetate (pH=5.20)를 0.7 mL min⁻¹으로 충분히 흘려주어 바탕이 안정화 되었을 때 실험을 시작하였다. HPLC 에 대한 실험 조건은 다음의 Table 2에 나타내었다.

셀레늄의 총량을 분석하기 위하여서 먼저 시료를 산분해하였다. 건조시킨 스피룰리나 시료 약 0.1 g을 테플론 비커에 넣고 셀레늄 동위원소 스파이크 용액과 31% H₂O₂ 약 1 mL, 그리고 70% HNO₃ 약 9 mL를 첨가하여 180 ℃에서 30분 동안 분해하였다.

분해가 완료된 시료 용액은 0.45 μm syringe filter로 filtering하였다.

상등액과 residue 각각에서의 총 셀레늄을 분석하기 위해 50 mL conical tube에 스피룰리나 시료 0.1 g, 증류수 10 g을 넣어주고 37 ℃에서 5분 동안 흔들어 주었다. 5분 후 4000rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상등액과 가라앉은 스피룰리나의 침전물을 분리하였다(Fig. 1-A). 분리한 상등액과 침전물은 총량의 경우에는 동위원소를 가한뒤에 마이크로파 산분해과정을 거쳐 분석하였다(B-1, C-1). 화학종 연구를 위하여서는 초음파추출을 하거나 효소를 이용한 단백질의 분해 후에 분석하였다.

증류수로 씻은 후((A)단계), 상등액을 0.45 μm syringe filter로 filtering 하고 직접 화학종 분석에 사용하였다(B-2). Residue는 다시 증류수 10 g을 넣어준 후 초음파 분쇄기로(QsonicaCL-334, K-corporation, Suwon, Korea) 1시간 동안 분쇄(pulse on 30초, pulse off 5초 반복)해준 후 filtering하여 분석하였다(C-2).

효소분해의 경우에는 (A) 단계를 거친 상등액에 0.1 M 인산완충용액 10 g과 protease XIV를 0.1 g을 넣어주었다. 37 ℃ bioshaker에서 36시간 동안 분해시킨 뒤 0.45 μm syringe filter로 filtering하여 사용하였다(B-3). Residue에는 0.05 M 인산완충용액 10 g을 넣고 초음파 분쇄기를 사용하여 1시간 동안 분쇄(pulse on 30초, pulse off 5초 반복)한 후 protease XIV 0.1 g을 넣었다. 37 ℃ bioshaker에서 36시간 동안 분해한 뒤 0.45 μm syringe filter로 filtering하였다(C-3). 전체적인 스피룰리나 속 셀레노 화합물 추출 과정을 다음 Fig. 1에 나타내었다.

Figure1.

Pre-treatment procedure of spirulina sample. (A) water extraction, (B) pre-treatment of supernatant, (C) pre-treatment of residue.

음이온 교환 컬럼을 사용하여 selenite, selenate, SeCys, SeMet, MeSeCys의 셀레늄 표준물을 잘 분리하고 검출할 수 있었다. 각각의 피크는 표준물 첨가법을 사용하여 그 위치를 확인하였다. 셀레늄 표준물 5개 화학종에 대한 분리결과를 아래 Fig. 2에 나타내었다. Selenate는 뒤에 나타나므로 피크의 모양을 잘 보이게 하기 위하여 농도를 4배 정도 더 넣어주었다.

Figure2.

Chromatogram of selenium standard solution mixture (99.6 ng g⁻¹ SeCys, 100 ng g⁻¹ MeSeCys, 98.9 ng g⁻¹ Selenite, 101 ng g⁻¹ SeMet, 400 ng g⁻¹ Selenate).

셀레늄으로 배양한 스피룰리나의 전체 셀레늄 총량은 414.9 ± 4.0 μg g⁻¹ (Average ± SD, n=9)이며, 상등액의 셀레늄 총량은 318.3 ± 5.5 μg g⁻¹, residue의 셀레늄 총량은 90.9 ± 0.5 μg g⁻¹으로 상등액의 셀레늄 농도가 residue보다 3배 이상 높게 나타났다. 즉, 증류수를 사용하여도 총 셀레늄의 75% 이상이 추출되는 것으로 보인다. 물론 어떤 셀레늄이 어느 정도 추출되는지는 화학종 분석을 하여야 할 것이며 그 결과는 뒤에 나타내었다. 상등액의 셀레늄 총량과 residue의 셀레늄 총량을 합한 값(409.2 μg g⁻¹)은 전체 셀레늄 총량(414.9 μg g⁻¹)의 약 98.6% 로서 매우 잘 일치하고 있다.

셀레늄으로 배양한 스피룰리나를 증류수로 추출한 상등액과 residue 각각에 대한 셀레늄 화학종을 조사하고 그 결과를 다음 Fig. 3과 4에 나타내었다. 상등액에서는 유기 셀레늄은 거의 보이지 않았고 주로 무기 셀레늄인 selenate가 검출되었는데, 이는 일차적으로는 배양한 셀레늄 용액이 selenate이기 때문인 것으로 보인다. 또한, 증류수 추출은 스피룰리나의 표면에서 이루어 진다고 볼 때 겉표면에는 주로 무기 셀레늄이 흡착된 상태로 존재한다고도 볼 수 있다.

Figure3.

Chromatogram of spirulina with water extraction for supernatant.

Figure4.

Chromatogram of spirulina with water extraction for residue.

작은 분자량의 유기 셀레늄은 거의 나타나지 않은 것으로 보아 짧은 시간의 수용액 추출로는 스피룰리나 내부의 셀레늄 화합물들이 많이 추출되지 않고 다만 외부(주로 표면)의 무기 셀레늄들이 추출되는 것으로 결론 지을 수 있다.

HPLC-ICP/MS에서 후 칼럼 동위원소 희석법으로 정량하여 206.4 ± 13.8 μg g⁻¹ (n=3)를 얻었는데 이 값은 상등액의 셀레늄 총량 318.3 μg g⁻¹의 64.8%이다. 나머지 35.2%는 나타나지 않는 것으로 보아 이들은 분자량이 큰 셀레노 화합물로서 아마 0.45 μm filter에 걸려져서 음이온 교환 칼럼을 사용한 본 연구에서는 검출되지 않은 것으로 추측된다.

Residue를 다시 마이크로파를 이용하여 추출하고(C-2 과정) 조사해보면 Fig. 4에서처럼 화학종 분포는 상등액과 매우 다르게 나타난다. 유기 셀레노 화학 종으로 주로 SeMet과 약간의 SeCys이 나타났으며 무기 화학종으로는 selenate가 약간 검출되었으나 그 농도는 높지 않았다.

이는 residue에는 22% 가량의 유기 셀레늄이 존재하지만, 주로 큰 분자 형태로 존재하여 수용액에는 쉽게 추출되지 않으며 마이크로파를 이용하여도 쉽게 분해되거나 추출되지 않는 것으로 보인다. SeMet을 정량한 결과 5.43μg g⁻¹으로 나타났으며 residue에서의 셀레늄 총량 90.86μg g⁻¹과 비교할 때 약 6% 정도로 매우 소량으로 나타난다는 것을 볼 수 있다. 즉, residue에서는 일반적인 방법으로는 쉽게 추출되지 않는 단백질 및 큰 분자형태의 셀레늄 화합물로 많이 존재한다고 보인다.

따라서 큰 분자형태의 셀레노 화합물을 추출하기 위하여 단백질 분해효소를 사용한 추출을 시도하였다. 이 때 효소 자체에 의한 셀레노 화합물 peak가 나타나는지 확인하였는데 Fig. 5에 효소 바탕 크로마토그램을 나타내었다. 크로마토그램을 보면 protease XIV에 매우 소량의 selenate가 나타나는 것을 확인할 수 있고 enzyme 바탕의 면적만큼 보정해주었다.

Figure5.

Chromatogram of enzyme blank.

Fig. 6에는 단백질 분해효소를 이용하여 셀레늄 단백질들을 분해시키고 추출한 상등액(Fig. 6-A)과 residue (Fig. 6-B)에 대한 결과를 나타내었다.

스피룰리나를 증류수로 추출한 상등액에는 selenate 한 가지 화학종만 나타났지만(Fig. 3) 그 상등액을 효소 분해한 크로마토그램 Fig. 6-(A)을 보면 무기 셀레노 화합물인 selenate 뿐만 아니라 약간의 유기 셀레노 화합물인 SeCys과 SeMet, 및 매우 소량이지만 MeSeCys이 나타나는 것을 볼 수 있다. 이것은 증류수 추출시 상등액에 비록 셀레늄 단백질이 존재하여도 filtering되었을 때에는 나타나지 않았지만, 단백질을 분해하였을 때에 비로소 나타나는 것으로 보인다. 하지만 residue를 단백질 분해효소로 분해시킨 Fig. 6-(B)의 크로마토그램을 보면 유기 화학종인 SeCys과 SeMet 및 MeSeCys 가 주로 나타나며 무기셀레늄은 거의 나타나고 있지 않다. 결국, 이 결과는 남아있는 residue에는 주로 유기 셀레늄들이 단백질 형태로 존재함을 알려주고 있다. 추출시에, 상등액에는 대부분의 무기 셀레늄과 약간의 단백질 및 유기 셀레늄이 추출되고 있음을 보여준다.

Figure6.

Chromatogram of enzyme decomposition for supernatant (A) and residue (B).

초음파를 사용한 추출에서도 증류수 추출과 비슷한 결과를 보여주는데 결국, 스피룰리나는 배양액의 무기 셀레늄을 이용하여 체내에 셀레늄 단백질 및 유기물질을 잘 합성하고 있는 것으로 보인다. 또한 배양에 사용된 무기 셀레늄은 주로 스피룰리나 표면에 흡착되어 있고 내부에는 거의 존재하지 않는 것으로 보이며 유기 셀레늄은 수용액으로 일부 추출이 되지만 대부분은 물에 녹아 나오지 않고 남아있는 것으로 보인다.

각 셀레노 화합물들을 후 칼럼 동위원소 희석법을 이용하여 정량하였다. 이 결과를 다음의 Table 3에 나타내었다. 상등액을 살펴보면 무기 selenate가 주 성분으로 농도는 222.7 ± 11.1 μg g⁻¹ (n=3)이고 유기 셀레늄 화합물인 SeCys과 SeMet가 일부 나타났으며 농도는 각각 15.20 ± 3.78 μg g⁻¹와 12.13 ± 0.84 μg g⁻¹이다. 상등액 전체 셀레늄 총량 318.3 ± 5.5 μg g⁻¹에 비교하면 상등액 효소 분해에 의한 셀레노 화합물의 농도가 250.0 ± 11.8 μg g⁻¹으로 78.5% 정도이다. 즉, 효소추출의 경우가 단순 증류수 추출의 경우보다 13.7% 더 증가하였지만 아직 약 21% 가량의 분해되지 않은 단백질 또는 다른 화합물이 존재한다고 볼 수 있다.

Residue에 대한 결과를 살펴보면 상등액과는 매우 다르게 무기 셀레늄은 거의 검출되지 않았고 주로 유기화합물들만 검출되었다. SeCys의 농도는 9.348 μg g⁻¹, SeMet의 농도는 18.23 μg g⁻¹, 그리고 MeSeCys이 1.5 μg g⁻¹이며 총합은 29.1 ± 2.6 μg g⁻¹으로 나타났다. 효소분해시에는 단순 증류수 추출에 비하여 유기 셀레늄 종의 농도가 약 5배 정도 증가하였다. 하지만 residue의 총량인 90.86 μg g⁻¹에 비교하면 약 32% 정도의 셀레늄만 나타나고 있다. 나머지 약 68% 가량은 상등액의 경우와 마찬가지로 셀레늄 단백질이 모두 분해되지 않았거나 또는 쉽게 추출되지 않는 다른 형태의 셀레늄 화합물로 존재하는 것으로 보인다.

셀레늄 화학종들의 분포와 구성비%를 Fig. 7에 간단히 나타내었다. 전체 셀레늄 중에서 상등액에는 76.7%, residue에는 21.9%가 분포되어 있다. 상등액에는 무기selenate가 대부분으로89.0%, 유기 셀레노 화합물은 SeCys와 SeMet 의 각각 6%와 5%로 구성되어 있다. Residue의 경우에는 무기 셀레늄 종은 거의 없으며 유기 셀레늄 종인 SeMet, SeCys, 및 MeSeCys이 63%, 32%, 및 5%를 차지하고 있다.

Figure7.

Composition of selenium species for supernatant and residue after enzyme hydrolysis of selenium fortified spirulina.

Residue의 경우에 상등액에 비하여 효소분해된 량이 낮은 것은 상등액은 주로 무기 셀레늄 형태이므로 쉽게 추출, 검출되는 반면에 residue의 경우에는 주로 복잡한 유기물 형태이므로 완전한 분해를 시키지 않으면 제대로 검출할 수 없기 때문으로 생각된다. 결국, 세포 속 셀레늄은 매우 다양한 형태로 존재하기 때문에^17,18 현재 사용한 protease 한 가지 효소로는 전부 분해할 수 없는 것으로 보인다.

셀레늄의 하루 최대 섭취 권장량은 400 μg미만으로 셀레늄으로 배양한 스피룰리나를 1.0 g만 섭취하여도 이미 하루 권장량을 뛰어넘는 범위이다. 무엇보다 독성이 있는 무기 셀레늄을 많이 섭취하게 되기 때문에 배양한 스피룰리나를 그냥 섭취하는 것은 적절치 않을 수 있으며 생산단계에서 무기 셀레늄을 적절히 제거하여야 할 것이다. 수용액으로 추출하거나 추가로 초음파 추출을 하면 효과적으로 대부분의 무기 셀레늄은 제거가 된다. Residue만 따로 분리하여 섭취한다면 무기 셀레늄을 제거할 수 있고 독성과 부작용이 작은 유기 셀레늄만을 효과적으로 섭취할 수 있게 될 것이다.